دیتیوتریتول (DTT) یک عامل کاهش دهنده رایج است که به عنوان افزودنی سبز جدید نیز شناخته می شود.این یک ترکیب آلی مولکولی کوچک با دو گروه مرکاپتان (-SH) است.DTT به دلیل خواص کاهشی و پایداری آن به طور گسترده در آزمایشات بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی استفاده می شود.
نقش اصلی DTT کاهش پیوندهای دی سولفیدی در پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی است.پیوند دی سولفیدی بخش مهمی از تاخوردگی و پایداری پروتئین است، اما تحت شرایط آزمایشی خاصی مانند آنالیز SDS-PAGE قابل کاهش، نوترکیب پروتئین و تاخوردگی، لازم است پیوند دی سولفیدی به دو گروه تیول کاهش یابد تا ساختار فضایی آشکار شود. پروتئینDTT می تواند با پیوندهای دی سولفید واکنش نشان دهد تا آنها را به گروه های مرکاپتان تقلیل دهد، بنابراین ساختار فضایی پروتئین را باز می کند و تجزیه و تحلیل و دستکاری آن را آسان می کند.
DTT همچنین می تواند برای محافظت از فعالیت و ثبات آنزیم استفاده شود.در برخی از واکنش های کاتالیز شده توسط آنزیم، فعالیت آنزیم ممکن است توسط اکسیدان کاهش یابد.DTT می تواند با اکسیدان ها واکنش نشان دهد تا آنها را به مواد بی ضرر تبدیل کند و در نتیجه از فعالیت و پایداری آنزیم محافظت کند.
در مقایسه با عوامل کاهنده سنتی مانند β-مرکاپتواتانول (β-ME)، DTT به عنوان یک عامل احیا کننده ایمن تر و پایدارتر در نظر گرفته می شود.این نه تنها در محلول آبی پایدار است، بلکه خواص کاهشی خود را در شرایط دمای بالا و اسید-باز حفظ می کند.
استفاده از DTT نسبتاً ساده است.به طور کلی DTT در یک بافر مناسب حل شده و سپس به سیستم آزمایشی اضافه می شود.غلظت بهینه DTT باید با توجه به آزمایش خاص تعیین شود و به طور کلی در محدوده 0.1-1 میلی مولار استفاده می شود.غلظت های پایین تر می تواند اثرات نامطلوب بر رشد سلول را کاهش دهد و می تواند سمیت سلولی را به دلیل بیان بیش از حد پروتئین های هدف کاهش دهد.غلظت های بالاتر ممکن است باعث بار متابولیک بیش از حد سلول شود و بر رشد سلولی و کارایی بیان تأثیر بگذارد.
راه تعیین غلظت بهینه می تواند ارزیابی سطح بیان پروتئین هدف با انجام تست های القایی IPTG در غلظت های مختلف باشد.آزمایش‌های کشت در مقیاس کوچک را می‌توان با استفاده از طیف وسیعی از غلظت‌های IPTG (به عنوان مثال 0.1 میلی‌مولار، 0.5 میلی‌مولار، 1 میلی‌مولار، و غیره) انجام داد و اثر بیان در غلظت‌های مختلف را می‌توان با تشخیص سطح بیان پروتئین هدف (مثلاً غربی) ارزیابی کرد. تشخیص لکه یا فلورسانس).با توجه به نتایج تجربی، غلظت با بهترین اثر بیان به عنوان غلظت بهینه انتخاب شد.
علاوه بر این، می‌توانید به ادبیات مربوطه یا تجربیات آزمایشگاه‌های دیگر نیز مراجعه کنید تا محدوده غلظت IPTG را که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرد در شرایط آزمایشی مشابه درک کنید و سپس با توجه به نیازهای آزمایشی بهینه‌سازی و تنظیم کنید.
توجه به این نکته مهم است که غلظت بهینه ممکن است بسته به سیستم‌های بیان مختلف، پروتئین‌های هدف و شرایط آزمایشی متفاوت باشد، بنابراین بهتر است به صورت موردی بهینه شود.
به طور خلاصه، DTT یک عامل کاهش دهنده رایج است که می تواند برای کاهش پیوندهای دی سولفیدی در پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی و محافظت از فعالیت و ثبات آنزیم استفاده شود.این به طور گسترده ای در آزمایشات بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی استفاده شده است.
زمان ارسال: سپتامبر 28-2023