دیتیوتریتول (DTT) یک عامل کاهنده رایج است که به عنوان افزودنی سبز جدید نیز شناخته میشود. این یک ترکیب آلی مولکولی کوچک با دو گروه مرکاپتان (-SH) است. به دلیل خواص کاهندگی و پایداری آن، DTT به طور گسترده در آزمایشهای بیوشیمی و زیستشناسی مولکولی مورد استفاده قرار میگیرد.
نقش اصلی DTT کاهش پیوندهای دیسولفیدی در پروتئینها و سایر مولکولهای زیستی است. پیوند دیسولفیدی بخش مهمی از تاخوردگی و پایداری پروتئین است، اما تحت شرایط آزمایشگاهی خاص، مانند آنالیز SDS-PAGE قابل کاهش، نوترکیبی و تاخوردگی پروتئین، لازم است پیوند دیسولفیدی به دو گروه تیول کاهش یابد تا ساختار فضایی پروتئین آشکار شود. DTT میتواند با پیوندهای دیسولفیدی واکنش دهد تا آنها را به گروههای مرکاپتان کاهش دهد، بنابراین ساختار فضایی پروتئین را باز میکند و تجزیه و تحلیل و دستکاری آن را آسان میسازد.
DTT همچنین میتواند برای محافظت از فعالیت و پایداری آنزیم مورد استفاده قرار گیرد. در برخی از واکنشهای کاتالیز شده توسط آنزیم، فعالیت آنزیم ممکن است توسط اکسیدان کاهش یابد. DTT میتواند با اکسیدانها واکنش دهد تا آنها را به مواد بیضرر کاهش دهد و در نتیجه از فعالیت و پایداری آنزیم محافظت کند.
در مقایسه با عوامل کاهنده سنتی مانند β-مرکاپتواتانول (β-ME)، DTT یک عامل کاهنده ایمنتر و پایدارتر در نظر گرفته میشود. این ماده نه تنها در محلول آبی پایدار است، بلکه خواص کاهندگی خود را در دمای بالا و شرایط اسید-باز نیز حفظ میکند.
استفاده از DTT نسبتاً ساده است. بهطورکلی، DTT در یک بافر مناسب حل شده و سپس به سیستم آزمایشی اضافه میشود. غلظت بهینه DTT باید طبق آزمایش خاص تعیین شود و بهطورکلی در محدوده 0.1 تا 1 میلیمولار استفاده میشود. غلظتهای پایینتر میتوانند اثرات نامطلوب بر رشد سلول را کاهش داده و سمیت سلولی ناشی از بیان بیش از حد پروتئینهای هدف را کاهش دهند. غلظتهای بالاتر ممکن است باعث بار متابولیکی بیش از حد سلول شوند و بر رشد سلول و راندمان بیان تأثیر بگذارند.
روش تعیین غلظت بهینه میتواند ارزیابی سطح بیان پروتئین هدف با انجام آزمایشهای القایی IPTG در غلظتهای مختلف باشد. آزمایشهای کشت در مقیاس کوچک را میتوان با استفاده از طیف وسیعی از غلظتهای IPTG (مثلاً 0.1 میلیمولار، 0.5 میلیمولار، 1 میلیمولار و غیره) انجام داد و اثر بیان در غلظتهای مختلف را میتوان با تشخیص سطح بیان پروتئین هدف (مثلاً وسترن بلات یا تشخیص فلورسانس) ارزیابی کرد. طبق نتایج آزمایش، غلظتی که بهترین اثر بیان را داشت به عنوان غلظت بهینه انتخاب شد.
علاوه بر این، میتوانید به منابع مربوطه یا تجربه سایر آزمایشگاهها نیز مراجعه کنید تا محدوده غلظت IPTG مورد استفاده رایج را در شرایط آزمایشگاهی مشابه درک کنید و سپس آن را بر اساس نیازهای آزمایشی بهینهسازی و تنظیم کنید.
لازم به ذکر است که غلظت بهینه ممکن است بسته به سیستمهای بیان مختلف، پروتئینهای هدف و شرایط آزمایش متفاوت باشد، بنابراین بهتر است بهینهسازی به صورت موردی انجام شود.
به طور خلاصه، DTT یک عامل کاهنده رایج است که میتواند برای کاهش پیوندهای دیسولفیدی در پروتئینها و سایر مولکولهای زیستی و محافظت از فعالیت و پایداری آنزیمها مورد استفاده قرار گیرد. این ماده به طور گسترده در آزمایشهای بیوشیمی و زیستشناسی مولکولی مورد استفاده قرار گرفته است.
زمان ارسال: ۲۸ سپتامبر ۲۰۲۳