IPTG (ایزوپروپیل-β-D-تیوگالاکتوزید) یک آنالوگ از سوبسترای β-گالاکتوزیداز است که بسیار القایی است. تحت القای IPTG، القاکننده میتواند با پروتئین سرکوبگر کمپلکس تشکیل دهد، به طوری که ترکیب پروتئین سرکوبگر تغییر میکند، به طوری که نمیتواند با ژن هدف ترکیب شود و ژن هدف به طور موثر بیان شود. بنابراین چگونه باید غلظت IPTG را در طول آزمایش تعیین کرد؟ آیا هرچه بزرگتر باشد، بهتر است؟
ابتدا، بیایید اصل القای IPTG را درک کنیم: اپرون لاکتوز (عنصر) E. coli شامل سه ژن ساختاری Z، Y و A است که به ترتیب بتا-گالاکتوزیداز، پرمئاز و استیل ترانسفراز را کد میکنند. lacZ لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز یا به آلو-لاکتوز هیدرولیز میکند. lacY به لاکتوز موجود در محیط اجازه میدهد تا از غشای سلولی عبور کرده و وارد سلول شود. lacA گروه استیل را از استیل-CoA به بتا-گالاکتوزید منتقل میکند که شامل حذف اثر سمی است. علاوه بر این، یک توالی عملیاتی O، یک توالی آغازین P و یک ژن تنظیمی I وجود دارد. کد ژن I یک پروتئین سرکوبگر است که میتواند به موقعیت O توالی اپراتور متصل شود، به طوری که اپرون (متا) سرکوب و خاموش میشود. همچنین یک جایگاه اتصال برای جایگاه اتصال پروتئین فعالکننده ژن کاتابولیک-CAP در بالادست توالی آغازگر P وجود دارد. توالی P، توالی O و جایگاه اتصال CAP با هم ناحیه تنظیمی اپران لک را تشکیل میدهند. ژنهای کدکننده سه آنزیم توسط همان ناحیه تنظیمی تنظیم میشوند تا بیان هماهنگ محصولات ژنی حاصل شود.
در غیاب لاکتوز، اپران لاک (متا) در حالت سرکوب قرار دارد. در این زمان، مهارکننده لاک که توسط توالی I تحت کنترل توالی پروموتر PI بیان میشود، به توالی O متصل میشود که از اتصال RNA پلیمراز به توالی P جلوگیری میکند و شروع رونویسی را مهار میکند. هنگامی که لاکتوز وجود دارد، اپران لاک (متا) میتواند القا شود. در این سیستم اپران (متا)، القاکننده واقعی خود لاکتوز نیست. لاکتوز وارد سلول میشود و توسط β-گالاکتوزیداز کاتالیز میشود تا به آلولاکتوز تبدیل شود. دومی، به عنوان یک مولکول القاکننده، به پروتئین سرکوبگر متصل میشود و ترکیب پروتئین را تغییر میدهد که منجر به تفکیک پروتئین سرکوبگر از توالی O و رونویسی میشود. ایزوپروپیل تیوگالاکتوزید (IPTG) همان اثر آلولاکتوز را دارد. این یک القاکننده بسیار قدرتمند است که توسط باکتریها متابولیزه نمیشود و بسیار پایدار است، بنابراین به طور گسترده در آزمایشگاهها مورد استفاده قرار میگیرد.
چگونه غلظت بهینه IPTG را تعیین کنیم؟ به عنوان مثال، E. coli را در نظر بگیرید.
سویه مهندسی ژنتیک شده E. coli BL21 حاوی pGEX نوترکیب مثبت (CGRP/msCT) به محیط کشت مایع LB حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر-1 آمپر تلقیح شد و به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده شد. کشت فوق برای کشت تکثیری به 10 بطری 50 میلی لیتری محیط کشت مایع LB تازه حاوی 50 میکروگرم بر میلی لیتر-1 آمپر با نسبت 1:100 تلقیح شد و هنگامی که مقدار OD600 برابر با 0.6 تا 0.8 شد، IPTG به غلظت نهایی اضافه شد. این غلظتها 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، 0.6، 0.7، 0.8، 0.9، 1.0 میلی مول بر لیتر است. پس از القا در همان دما و همان زمان، ۱ میلیلیتر از محلول باکتریایی از آن گرفته شد و سلولهای باکتریایی با سانتریفیوژ جمعآوری و با SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفتند تا تأثیر غلظتهای مختلف IPTG بر بیان پروتئین بررسی شود و سپس غلظت IPTG با بیشترین بیان پروتئین انتخاب شود.
پس از آزمایشها، مشخص خواهد شد که غلظت IPTG تا حد امکان زیاد نیست. دلیل این امر سمیت خاص IPTG برای باکتریها است. افزایش غلظت نیز سلول را از بین میبرد؛ و به طور کلی، ما امیدواریم که هرچه پروتئین محلول بیشتری در سلول بیان شود، بهتر است، اما در بسیاری از موارد وقتی غلظت IPTG خیلی زیاد است، مقدار زیادی از اینکلوژن تشکیل میشود. بدن، اما مقدار پروتئین محلول کاهش مییابد. بنابراین، مناسبترین غلظت IPTG اغلب نه هر چه بیشتر بهتر، بلکه هر چه غلظت کمتر باشد، بهتر است.
هدف از القا و کشت سویههای مهندسی ژنتیک شده، افزایش بازده پروتئین هدف و کاهش هزینهها است. بیان ژن هدف نه تنها تحت تأثیر عوامل خود سویه و پلاسمید بیان قرار میگیرد، بلکه تحت تأثیر سایر شرایط خارجی مانند غلظت القاکننده، دمای القا و زمان القا نیز قرار میگیرد. بنابراین، به طور کلی، قبل از بیان و خالصسازی یک پروتئین ناشناخته، بهتر است زمان القا، دما و غلظت IPTG بررسی شود تا شرایط مناسب انتخاب شده و بهترین نتایج تجربی به دست آید.
زمان ارسال: ۳۱ دسامبر ۲۰۲۱